Хьюз, Д. А. (1999). Влияние диетических антиоксидантов на иммунную функцию взрослых людей среднего возраста. Proc. Nutr. Soc. 58, 79–84. DOI: 10.1079 / PNS199

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хатуа, с., и Ачарья, К. (2016). Влияние параметров экстракции на физико-химические характеристики и антиоксидантную активность водорастворимых полисахаридов из Macrocybe gigantea (Massee) Pegler & Lodge. J. Food Sci. Technol. 53, 1878–1888. DOI: 10.1007 / s13197-015-2145-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хатуа С., Ачарья К. (2017). Щелочной экстрактивный сырой полисахарид из Russula senecis обладает антиоксидантным потенциалом и стимулирует реакцию врожденного иммунитета. J. Pharm. Pharmacol. 69, 1817–1828 гг. DOI: 10.1111 / jphp.12813

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хатуа, С., Дутта, А. К., Чандра, С., Палои, С., Дас, К., и Ачарья, К. (2017a). Представляем новый гриб от сообщества микофагов с акцентом на биомедицинскую эффективность. PLoS One 12: e0178050. DOI: 10.1371 / journal.pone.0178050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хатуа, С., Гош, С., и Ачарья, К. (2017b). Упрощенный метод микротитровального анализа антиоксидантной активности in vitro. Asian J. Pharm. 11, S327 – S335.

Google Scholar

Хатуа С., Пол С. и Ачарья К. (2013). Гриб как потенциальный источник антиоксидантов нового поколения: обзор. Res. J. Pharm. Technol. 6, 496–505.

Google Scholar

Ким, Э. Дж., Ли, М. Ю. и Чон, Ю. Дж. (2015). Силимарин подавляет морфологические изменения в LPS-стимулированных макрофагах, блокируя путь NF-κB. Korean J. Physiol. Pharmacol. 19, 211–218. DOI: 10.4196 / kjpp.2015.19.3.211

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клаус А., Козарски М., Никшич М., Яковлевич Д., Тодорович Н. и Гриенсвен Л. Дж. Л. Д. (2011). Антиоксидантная активность и химическая характеристика полисахаридов, экстрагированных из базидиомицета Schizophyllum commune . LWT Food Sci. Technol. 44, 2005–2011. DOI: 10.1016 / j.lwt.2011.05.010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Козарски М., Клаус А., Никшич М., Яковлевич Д., Хелспер, Дж. П. Ф. Г. и Ван Гриенсвен, Л. Дж. Л. Д. (2011). Антиоксидантная и иммуномодулирующая активность экстрактов полисахаридов лекарственных грибов Agaricus bisporus , Agaricus brasiliensis , Ganoderma lucidum и Phellinus linteus . Food Chem. 129, 1667–1675. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2011.06.029

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Дж.С., Сыница, А., Ким, Х. Б., Чой, Д. Дж., Ли, С., Ли, Дж. И др. (2013). Очистка, характеристика и иммуномодулирующая активность пектинового полисахарида, выделенного из плодов шелковицы корейской Oddi ( Morus alba L.). Int. Иммунофармакол. 17, 858–866. DOI: 10.1016 / j.intimp.2013.09.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, К., Хуан, К., Фу, X., Юэ, X.-J., Лю, Р. Х., и Ю, Л.-Дж. (2015). Характеристика, антиоксидантная и иммуномодулирующая активность полисахаридов из Prunella vulgaris Linn. Int. J. Biol. Макромол. 75, 298–305. DOI: 10.1016 / j.ijbiomac.2015.01.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю, Л., Ли, Х., Сюй, Р., и Ли, П. (2017). Эксполисахариды из Bifidobacterium animalis RH активируют макрофаги RAW 264.7 через толл-подобный рецептор 4. Food Agric. Иммунол. 28, 149–161. DOI: 10.1080 / 09540105.2016.1230599

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менгини, Л., Leporini, L., Vecchiotti, G., Locatelli, M., Carradori, S., and Ferrante, C. et al. (2018). Crocus sativus L. рыльца и побочные продукты : качественный отпечаток пальца, антиоксидантный потенциал и активность по ингибированию ферментов. Food Res. Int. 109, 91–98. DOI: 10.1016 / j.foodres.2018.04.028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Митра П., Хатуа С. и Ачарья К. (2013). Улавливание свободных радикалов и активация NOS водорастворимого сырого полисахарида из Pleurotus ostreatus . Asian J. Pharm. Clin. Res. 6, 67–70.

Google Scholar

Прити, С., и Мэри, С. А. (2016). Скрининг природных полисахаридов, экстрагированных из плодов Pithecellobium dulce в качестве фармацевтического адъюванта. Int. J. Biol. Макромол. 92, 347–356. DOI: 10.1016 / j.ijbiomac.2016.07.036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Прието П., Пинеда М. и Агилар М. (1999). Спектрофотометрическое количественное определение антиоксидантной способности через образование комплекса фосфомолибдена: специфическое применение для определения витамина Е. Анал. Биохим. 269, 337–334. DOI: 10.1006 / abio.1999.4019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пуэртоллано, М. А., Пуэртоллано, Э., Сьенфуэгос, Г. Б., и Пабло, М. А. (2011). Диетические антиоксиданты: иммунитет и защита шланга. Curr. Вершина. Med. Chem. 11, 1752–1766. DOI: 10.2174 / 156802611796235107

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Разали Ф. Н., Исмаил А., Абидин Н. З. и Шуиб А. С. (2014).Стимулирующее действие полисахаридной фракции из Solanum nigrum на мышиные макрофаги RAW 264.7. PLoS One. 9: e108988. DOI: 10.1371 / journal.pone.0108988

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рутес, А. К., Смидерл, Ф. Р., и Якомини, М. (2015). D-глюканы из съедобных грибов: обзор методов экстракции, очистки и химической характеристики. Carbohydr. Polym. 117, 753–761. DOI: 10,1371 / журнал.pone.0108988

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саха, С., Хатуа, С., Палои, С., и Ачарья, К. (2013). Антиоксидантные и активирующие свойства синтазы оксида азота водорастворимых полисахаридов из Pleurotus florida . Int. J. Green Pharm. 7, 182–188. DOI: 10.4103 / 0973-8258.120190

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Shi, J., Zhang, J., Sun, Y., Qu, J., Li, L., Prasad, C., et al. (2016). Физико-химические свойства и антиоксидантная активность полисахаридов, последовательно извлекаемых из осадка семян пиона. Int. J. Biol. Макромол. 91, 23–30. DOI: 10.1016 / j.ijbiomac.2016.05.082

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sun, H., Ni, X., Zenga, D., Zou, F., Yang, M., Peng, Z., et al. (2017). Двунаправленная иммуномодулирующая активность ферментированных полисахаридов из Yupingfeng . Res. Вет. Sci. 110, 22–28. DOI: 10.1016 / j.rvsc.2016.10.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вс, З., Чжан, Л., Чжан, Б., и Ню, Т. (2010). Структурная характеристика и антиоксидантные свойства полисахаридов плодовых тел Russula virescens . Food Chem. 118, 675–680. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2009.05.036

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сыница А., Мичкова К., Сыница А., Яблонски И., Спевачек Ю., Эрбан В. и др. (2009). Глюканы плодовых тел культурных грибов Pleurotus ostreatus и Pleurotus eryngii : структура и потенциальная пребиотическая активность. Carbohydr. Polym. 76, 548–556. DOI: 10.1016 / j.carbpol.2008.11.021

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Terra, X., Valls, J., Vitrac, X., Mérrillon, J., Arola, L., Ardèvol, A., et al. (2007). Процианидины виноградных косточек действуют как противовоспалительные агенты в макрофагах RAW 264.7, стимулированных эндотоксинами, путем ингибирования сигнального пути NFκB. J. Agric. Food Chem. 55, 4357–4365. DOI: 10.1021 / jf0633185

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Венкаталакшми, П., Вадивель, В., Бринда, П. (2016). Роль фитохимических веществ как иммуномодулирующих агентов: обзор. Int. J. Green Pharm. 10, стр. 1 – стр. 18.

Google Scholar

Вентер, Г., Орлеманс, Ф. Т. Дж. Дж., Вейерс, М., Виллемсе, М., Франсен, Дж. А. М., и Виринга, Б. (2014). Глюкоза контролирует морфодинамику LPS-стимулированных макрофагов. PLoS One 9: e96786. DOI: 10.1371 / journal.pone.0096786

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Влатка, П., Весна, З., Слободан, Г., Синиша, С., Инес, П., Лана, В. (2010). Биологические эффекты дрожжевых β-глюканов. Agric. Conspec. Sci. 75, 149–158.

Google Scholar

Wang, C., Yu, X., Cao, Q., Wang, Y., Zheng, G., Tan, T. K., et al. (2013). Характеристика мышиных макрофагов из костного мозга, селезенки и брюшины. BMC Immunol. 14: 6. DOI: 10.1186 / 1471-2172-14-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, X., Чжан, Ю., Лю, З., Чжао, М., и Лю, П. (2017). Очистка, характеристика и антиоксидантная активность полисахаридов, выделенных из коры Periplocae. Молекулы 22: E1866. DOI: 10.3390 / молекулы22111866

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Антиоксидантные свойства и ингибирование ангиотензинпревращающего фермента высокоактивными пептидами из пшеничного глютена

Химический состав и аминокислотный состав WOP

Образец WOP содержал следующие компоненты (в сухом виде): белки (пептиды), 94.52 ± 0,56%; липиды 0,05 ± 0,01%; зола 2,32 ± 0,25%; влажность 2,35 ± 0,23%. Как и ожидалось, пептиды были основным компонентом WOP. Растворение образцов пшеничной клейковины во время гидролиза и удаление нерастворимых, непереваренных небелковых веществ после гидролиза привело к высокому содержанию белка ²⁵ . Нанофильтрация удалила большую часть минеральных солей, а оставшуюся золу образовали Na ⁺ и Cl ^—.

Как показано в таблице 1, WOP были богаты глутаминовой кислотой (35.23 ± 0,12%), пролин (10,62 ± 0,08%), лейцин (5,03 ± 0,05%), серин (4,12 ± 0,01%) и фенилаланин (3,81 ± 0,05%). Кроме того, соотношение содержания незаменимых (лизин, триптофан, фенилаланин, метионин, треонин, изолейцин, лейцин и валин) и полусущественных (аргинин и гистидин) аминокислот составляло 21,95% и 4,48% соответственно. Богатый аминокислотный состав оказывает значительное влияние на регуляцию физиологических функций человека. Например, глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором, используемым в синапсах центральной нервной системы, и оказывает важное влияние на поддержание передачи сигналов нервных клеток ²⁵ .Как первая ограничивающая аминокислота, лизин может влиять на абсорбцию и использование других аминокислот, а также на метаболизм и иммунную функцию. ²⁶ . Лейцин, изолейцин и пролин представляют собой аминокислоты с разветвленной цепью и являются важными источниками метаболической энергии ²⁷ . Функциональная активность пептида в решающей степени зависит от типа и количества аминокислот, входящих в его состав. Предыдущие исследования показали, что многие аминокислоты и их производные, такие как глутаминовая кислота, лейцин, гистидин, аргинин, тирозин, лизин, валин, аланин, цистеин и пролин, обладают антиоксидантным действием.Kong et al. ²⁸ сообщили, что олигопептиды кукурузы обладают значительной антиоксидантной способностью, а такие аминокислоты, как лейцин, обладают сильным хелатирующим действием. В WOP относительное содержание антиоксидантных аминокислот достигает 65,18%, таких как лейцин, аргинин, тирозин, цистеин, валин, аланин и другие аминокислоты, потенциально приводящие к хелатированию ионов металлов, поэтому WOP может быть природным веществом. с антиоксидантной активностью. Кроме того, согласно предыдущим исследованиям, многие пептиды, ингибирующие АПФ, содержат валин, аланин, лейцин, тирозин и фенилаланин ²⁹ , что позволяет предположить, что WOP может содержать пептиды, ингибирующие АПФ, и иметь потенциальную ингибирующую активность.

Относительное молекулярно-массовое распределение WOP

Для анализа молекулярно-массового распределения WOP применялась эксклюзионная хроматография с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Согласно результатам (рис. 1), среди WOP преобладали пептиды с молекулярной массой ниже 1000 (94,32%). Большинство пептидов в WOP (61,23%) находились в диапазоне молекулярной массы 500–140 и были в основном ди- и трипептидами.Согласно сообщениям, ди- и трипептиды активно транспортируются в эпителиальных клетках кишечника с помощью специфических пептидных транспортеров (например, PepT1, PepT2), а аминокислотные остатки ди- и трипептидов системно абсорбируются быстрее, чем свободные аминокислоты ^30,31 .

Хроматограмма WOP, показывающая распределение молекулярной массы (MW). На вставке показано содержание пептидов с различными классами диапазонов MW в WOP.

Эти данные показывают, что двухэтапный ферментативный гидролиз с последующим многоступенчатым разделением может эффективно удалять большие пептиды или непереваренные белки и производить олигопептиды.Этот метод ферментативного гидролиза также успешно применялся в прошлых исследованиях ^32,33 . Молекулярная структура и масса сильно влияют на функциональные характеристики пептидов, на которые сильно влияют условия обработки. Широко известно, что большинство пептидов, ингибирующих АПФ, из пищевых белков имеют относительно низкую молекулярную массу, большинство из которых являются короткими пептидами менее 1000 Да ³⁴ . Более того, предыдущие исследования показали, что по сравнению с относительно большими пептидами, небольшие пептиды обладают более высокой антиоксидантной активностью, а некоторые ди- и трипептиды показали большую антиоксидантную активность, чем составляющие их аминокислоты ^35,36 .Согласно недавним достижениям в тест-системах окислитель-антиоксидант, эффекты небольших пептидов были сильнее, чем эффекты более крупных пептидов и белков ³⁷ .

Антиоксидантные свойства WOP

В качестве ферментативного гидролизата WOP продемонстрировал сильную поглощающую способность против 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH), гидроксила и 2,2′-азинобис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты). диаммониевая соль (ABTS) свободные радикалы. Концентрация для 50% максимального эффекта (EC ₅₀ ) DPPH и активности по улавливанию свободных радикалов гидроксила составляла 1.52 ± 0,09 и 6,23 ± 0,18 мг / мл, соответственно, а активность ABTS по улавливанию свободных радикалов составила 1,23 ± 0,03 ммоль эквивалента Trolox (TE) / г образца. Zhang et al. гидролизованный белок зародышей пшеницы с помощью алкалазы 2,4 л для получения пептидов зародышей пшеницы (молекулярная масса <1000 Да), и было обнаружено, что значение EC ₅₀ для DPPH составляет 2,77 мг / мл ³⁸ . Карами и др. оценили активность DPPH по улавливанию свободных радикалов трех гидролизатов белка зародышей пшеницы, приготовленных с помощью алкалазы, пепсина или протеиназы K, и значения EC ₅₀ были равны 1.56, 1,78 и 1,83 мг / мл соответственно ²⁴ . По сравнению с вышеупомянутыми исследованиями, активность WOP по улавливанию свободных радикалов DPPH в этом исследовании была немного выше. Кроме того, значение WOP для гидроксильных свободных радикалов согласно EC ₅₀ было лучше, чем у пептидов, полученных из обезжиренных зародышей пшеницы (6,04 мг / мл) ³⁹ . Кроме того, WOP продемонстрировал высокое значение емкости абсорбции кислородных радикалов (ORAC) (1216,87 ± 11,51 ммоль TE / г образца) (таблица 2). Пептиды с высоким содержанием антиоксидантов, полученные путем гидролиза белков куриных яиц с помощью различных протеаз, имели значение ORAC между 900–1300 ммоль эквивалента тролокса (TE) / г образца, что близко к WOP ⁴⁰ .Более того, эти антиоксидантные свойства WOP показали сильную дозозависимую зависимость. Результаты показали, что двухэтапный ферментативный гидролиз является эффективным подходом для получения антиоксидантного гидролизата из пшеничного глютена. Учитывая его очевидные антиоксидантные свойства, аминокислоты или пептиды, содержащиеся в WOP, действуют как доноры электронов и реагируют со свободными радикалами с образованием стабильных продуктов и цепных реакций концевых радикалов. Среди четырех типов результатов системы анализа антиоксидантов, ABTS активность WOP по улавливанию свободных радикалов была чрезвычайно высокой.Более того, эксперимент ABTS, казалось, был очень эффективным в оценке антиоксидантной способности. Поэтому в дальнейших экспериментах был использован анализ свободных радикалов антиоксидантов ABTS.

АПФ-ингибирующая активность WOP

Как показано на фиг. 2, АПФ-ингибирование WOP постепенно увеличивалось с увеличением концентрации. Степень ингибирования составляла 77% при концентрации 2,5 мг / мл, а значения половины максимальной ингибирующей концентрации (IC ₅₀ ) равнялись 0.68 ± 0,03 мг / мл. По данным Bougatef et al. ⁴¹ , гидролизат белка сардины имел значение IC ₅₀ 1,2 мг / мл для АПФ. Gu et al. ³³ показали, что значение IC ₅₀ олигопептидов, полученных из черной шелковистой птицы, для ACE составляло 2,86 мг / мл. Более того, после измерения ингибирующей активности АПФ 48 гидролизатов морских белков He et al. ⁴² найдено значение IC ₅₀ в диапазоне от 0,17 до 501,7 мг / мл. По сравнению с этими данными, WOP обладал относительно высокой активностью ингибирования АПФ.Поскольку в WOP было много видов пептидов, мы предположили, что некоторые из пептидов в WOP могут быть конкурентными ингибиторами с большим сродством к активной области АПФ, чем WOP. Согласно исследованиям ^32,34 , ингибирующая активность пептидов в отношении АПФ может быть связана с длиной их пептидных цепей. Молекулярные массы пептидов, ингибирующих АПФ, относительно низкие, обычно менее 1000. Кроме того, гидрофобные аминокислоты на С-конце антигипертензивных пептидов имеют важное значение для активности антигипертензивных пептидов ³³ .WOP может содержать относительно большое количество пептидов, которые могут ингибировать АПФ. Следовательно, есть веская причина продолжать идентификацию и очистку пептидов, ингибирующих АПФ, из WOP.

Ангиотензин-I-превращающий фермент (АПФ) ингибирующая активность WOP при различных концентрациях. Данные представляют собой среднее значение трех экспериментов. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения.

ABTS улавливание свободных радикалов и ингибирующие АПФ характеристики фракций высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC)

Колонка RP-HPLC применялась для фракционирования WOP для определения возможного влияния состава пептидов на антиоксидантную активность и ингибирование АПФ Мероприятия.На рис. 3А показаны профили элюирования WOP. В соответствии с формой, высотой, площадью и разрешением пиков были собраны шесть компонентных пиков, фракции 1–6, где каждый компонентный пик не обязательно представлял один пептид. Повторную хроматографию использовали для отдельного сбора шести фракций и определяли их активность по улавливанию свободных радикалов и АПФ. Согласно рис. 3B, фракции 2–6 проявляли равную или даже более высокую активность по улавливанию радикалов ABTS (0,91–1,62 ммоль TE / г образца), чем WOP (1.23 ± 0,03 ммоль TE / г образца), но фракция 1 имела более низкую активность.

( A ) Профиль элюирования WOP, разделенного методом RP-HPLC, на колонке XBridge BEh230 C18 (4,6 мм × 250 мм) при скорости потока 0,6 мл / мин с линейным градиентом растворителя A ( 0,1% TFA в воде Milli-Q, об. / Об.) И растворителе B (80% ацетонитрила с 0,1% TFA, об. / Об.). Было собрано шесть фракций и обозначено как фракции 1–6. ( B ) Активность ABTS по улавливанию свободных радикалов собранных фракций из системы RP-HPLC.Результаты выражены в ммоль эквивалента Trolox (TE) / г образца. ( C ) Ингибирующая активность ACE собранных фракций из системы RP-HPLC при концентрации 0,7 мг / мл. Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3).

Результаты ингибирования АПФ были аналогичны приведенным выше, где фракции 2-6 показали более высокую ингибирующую активность АПФ (61,21–89,36%), чем WOP, а фракция 1 продемонстрировала более низкую активность ингибирования АПФ (34,18 ± 2,06%) при концентрация 0.7 мг / мл (рис. 3C). Ингибирующая активность фракций 5 и 6 была в 1,39 и 1,74 раза выше, чем у WOP, соответственно.

Согласно этим результатам, некоторые пептиды в определенных фракциях могут иметь относительно более высокую активность ABTS по улавливанию свободных радикалов и ингибирование АПФ (или присутствуют в более высокой концентрации), чем пептиды в других фракциях. Поэтому для дальнейшей идентификации и скрининга активных пептидов были выбраны все фракции 1–6.

Очистка и распознавание антиоксидантных пептидов и пептидов, ингибирующих АПФ, в WOP

Для фракций 1–6 использовали квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр с электрораспылением и ионизацией (ESI-Q-TOF2) для распознавания активных пептидов, что привело к идентификация 40 активных пептидов из WOP, аминокислотные последовательности и относительные молекулярные массы которых перечислены в таблице 3.Эти пептиды состояли из 2–6 аминокислот, что соответствовало анализу относительной молекулярной массы, описанному выше. Сообщалось, что на антиоксидантную и ингибирующую АПФ активность пептидов сильно влияла молекулярная масса пептида. Peng et al. ⁴³ сообщил, что фракция пептидов 100–2800 Да, очищенная из гидролизата сывороточного белка, обладала самой сильной антиоксидантной активностью. Сайга и др. ⁴⁴ изучили пептиды в гидролизованном экстракте мышц куриной грудки, и результат показал, что небольшие пептиды (<1000 Да) показали более высокую активность, чем пептиды с молекулярной массой> 1000 Да.Все пептиды, идентифицированные в нашем исследовании, были небольшими пептидами с молекулярной массой <1000 Да. Следовательно, ожидалось, что пептиды, идентифицированные в этом исследовании, будут проявлять антиоксидантную и ингибирующую активность АПФ. Выбор пептидов для анализов активности ABTS по улавливанию свободных радикалов и активности ингибирования ACE был основан на предыдущем опыте и связанных с ним ссылках. Поэтому мы провели предварительный анализ структурных характеристик и аминокислотного состава антиоксидантных пептидов и пептидов, ингибирующих АПФ.В частности, согласно предыдущим исследованиям, некоторые ди- и трипептиды с ароматическими аминокислотными остатками (Tyr или Trp) и пептиды, содержащие Arg, Pro, Gln или Asn, с высокой вероятностью обладают сильной антиоксидантной активностью ^1,10,12 . Кроме того, пептиды, несущие Tyr, Phe, Trp, Pro или гидрофобный аминокислотный остаток на С-конце, обладают сильной ингибирующей активностью АПФ ⁴⁵ . На основе этих отчетов мы выбрали и синтезировали 15 пептидов в качестве потенциальных кандидатов (таблица 4) с этими предпочтительными характеристиками из фракций 2–6 для дальнейшего тестирования, чтобы определить их активность по улавливанию свободных радикалов ABTS и активность ингибирования АПФ.

Общая антиоксидантная способность может быть легко оценена с помощью эксперимента ABTS. На фигуре 4A показана способность ABTS улавливать свободные радикалы, в которой пять пептидов (Leu-Tyr, Pro-Tyr, Tyr-Gln, Ala-Pro-Ser-Tyr, Arg-Gly-Gly-Tyr) имели чрезвычайно высокие характеристики.Их активность по улавливанию свободных радикалов ABTS составляла 6,07 ± 0,38, 7,28 ± 0,29, 11,18 ± 1,02, 5,93 ± 0,20 и 9,04 ± 0,47 ммоль эквивалента тролокса (ТЕ) / г образца, соответственно. Активность по улавливанию свободных радикалов была в 4,93, 5,92, 9,08, 4,82 и 7,35 раз выше активности WOP для этих пептидов, соответственно, а другие пептиды обладали более слабой способностью ABTS улавливать свободные радикалы. Хотя некоторые пептиды не проявляют сильной активности ABTS по улавливанию свободных радикалов, мы не уверены, обладают ли они синергетическим действием с другими пептидами для повышения общей антиоксидантной активности WOP.С другой стороны, на основании этих результатов мы были уверены, что по крайней мере пять пептидов (Leu-Tyr, Pro-Tyr, Tyr-Gln, Ala-Pro-Ser-Tyr и Arg-Gly-Gly-Tyr) входят в состав WOP. основной вклад в деятельность ABTS по улавливанию свободных радикалов. Активные центры и группы, которые они выставили, могут действовать как доноры электронов, останавливать цепную реакцию свободных радикалов и в конечном итоге достигать антиоксидантных эффектов ³³ . Beermann et al. ⁴⁶ выделили и очистили соевые пептиды и обнаружили, что дипептид Leu-Tyr обладает превосходными антиоксидантными эффектами, что хорошо согласуется с нашими экспериментами в данном документе.Насколько нам известно, другие четыре пептида (Pro-Tyr, Tyr-Gln, Ala-Pro-Ser-Tyr, Arg-Gly-Gly-Tyr) ранее не упоминались как антиоксидантно-активные пептиды. Chen et al. ⁴⁷ ранее предполагали, что короткие пептиды с ароматическими аминокислотными остатками (Trp или Tyr) могут обладать сильной антиоксидантной активностью. С-концы четырех из пяти антиоксидантных пептидов, идентифицированных в настоящем исследовании, были Tyr. Сайто и др. ⁴⁸ сообщил, что трипептид Tyr-His-Tyr, отделенный от гидролизата соевого белка, обладает сильной антиоксидантной способностью и большим синергическим действием с фенольными антиоксидантами (например,g., BHA и δ-токоферол). Благодаря особым способностям фенольных и индольных групп антиоксидантная активность Trp и Tyr может действовать как доноры водорода. Имея более длительный срок жизни, чем у простых пероксирадикалов, гораздо более стабильные феноксильные и индоильные радикалы ингибируют любую обратную реакцию или распространение опосредованной радикалами цепной реакции перекисного окисления ⁴⁸ . Кроме того, окисление определенных сайтов может происходить из-за связывания ионов металлов или других исходных материалов на определенных сайтах полипептидов.Селективная модификация пептида остатками His, Pro, Met, Cys, Arg, Lys и Trp также может быть связана с его антиоксидантной активностью ⁴⁸ .

ABTS активность по улавливанию свободных радикалов ( A ) и ингибирующая активность ангиотензин I-превращающего фермента (ACE) ( B ) 15 пептидов, идентифицированных из фракций 2–6 с помощью квадрупольного времени пролета (Q -TOF2) масс-спектрометрия. Концентрация пептидов, используемых для анализа ингибирующей активности АПФ, составляла 0.7 мг / мл. Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). TE расшифровывается как эквивалент Trolox.

На рис. 4В показано, что 15 пептидов проявляли различные ингибирующие активности АПФ при 0,7 мг / мл (в диапазоне от 1,94 до 83,13%). Среди них пять пептидов, Leu-Tyr, Leu-Val-Ser, Tyr-Gln, Ala-Pro-Ser-Tyr и Arg-Gly-Gly-Tyr, привлекли наше внимание из-за их повышенной ингибирующей активности против АПФ по сравнению с что из WOP. При этой концентрации их активности составляли 1,59, 1,64, 1,18, 1,04 и 1.В 01 раз больше, чем у WOP, соответственно. Кроме того, мы определили значения IC ₅₀ для пяти активных пептидов: Leu-Tyr (0,31 ± 0,02 ммоль / л), Leu-Val-Ser (0,60 ± 0,03 ммоль / л), Tyr-Gln (2,00 ± 0,13 ммоль / л). / Л), Ala-Pro-Ser-Tyr (1,47 ± 0,08 ммоль / л) и Arg-Gly-Gly-Tyr (1,48 ± 0,11 ммоль / л). Рассчитанные значения IC ₅₀ для пяти активных пептидов составили 0,09, 0,19, 0,62, 0,64 и 0,67 мг / мл, соответственно, в единицах мг / мл, которые составили 7,56, 3,58, 1,10, 1,06 и 1,01. раз больше, чем WOP (0.68 ± 0,03 мг / мл) соответственно. Насколько нам известно, нет сообщений о том, что три пептида Leu-Val-Ser, Ala-Pro-Ser-Tyr и Arg-Gly-Gly-Tyr обладают ингибирующей активностью в отношении АПФ. Однако есть сообщения, что дипептид Leu-Tyr обладал ингибирующей активностью в отношении АПФ (IC ₅₀ = 38,5 мкМ) и мог снижать артериальное давление ^49,50 . Кроме того, Leu-Tyr и Leu-Val-Arg, ранее выделенные из гидролизата мышц сардины, обладают хорошим ингибирующим действием на АПФ ⁴¹ . Также уже было известно, что дипептид Tyr-Gln выделен из гречихи в качестве пептида, ингибирующего АПФ (IC ₅₀ = 628 мкМ) ⁵¹ .В исследовании Balti et al. ⁵² , было обнаружено, что Ala-His-Ser-Tyr, выделенный из каракатиц, обладает ингибирующей активностью в отношении АПФ (IC ₅₀ = 11,6 мкМ). Интересно, что структура Ala-Pro-Ser-Tyr, обнаруженная в настоящем исследовании, была аналогична структуре Ala-His-Ser-Tyr. Следовательно, был сделан вывод, что эти две пептидные последовательности могут приводить к хорошему связыванию с АПФ. Для Arg-Gly-Gly-Tyr другой аналогичный тетрапептид, Tyr-Gly-Gly-Tyr, оказался эффективным ингибитором АПФ in vitro Saito et al. ⁵³ . Кроме того, продукт расщепления Tyr-Gly-Gly-Tyr, Gly-Gly-Tyr, трипептида, также проявлял хорошую ингибирующую активность (IC ₅₀ = 1,3 мкМ), как показано Shamloo et al. ⁵⁴ . В меньшей степени высвободившаяся аминокислота тирозин может также проявлять ингибирующую активность в отношении АПФ. ⁵⁵ . В настоящем исследовании Arg-Gly-Gly-Tyr, который имеет последовательность Gly-Gly-Tyr, проявил сильную ингибирующую активность в отношении АПФ. Его активность может быть обусловлена ​​предпочтительной аминокислотной последовательностью (Gly-Gly-Tyr) или аминокислотой (тирозин) и их синергическим действием с аминокислотой аргинином на N-конце.Что касается связи между структурой и активностью пептидов, ингибирующих АПФ, Ryan et al. ⁵⁶ предположил, что гидрофобные, разветвленные или ароматические аминокислоты являются важными компонентами пептидов, ингибирующих АПФ, в то время как гидрофильные аминокислоты обладают слабой ингибирующей активностью в отношении АПФ, поскольку они несовместимы с активным сайтом АПФ. Cheung et al. ^57, отметили, что активные пептиды, как правило, содержат Pro, Phe или Tyr на С-конце и Val или Ile на N-конце. Некоторые пептиды, ингибирующие АПФ, с аналогичными структурами на концах C / N, такие как лактотрипептиды Val-Pro-Pro и Ile-Pro-Pro в йогурте, Ile-Ala-Pro в гидролизате глиадина, Ala-Pro и Val-Arg в лососе. гидролизат, Tyr-Ala-Pro и Val-Ile-Ile в гидролизате каракатиц и Ile-Gln-Pro в водорослях были выделены и идентифицированы ^{22,58,59,60,61} .Среди этих пептидов в клинических испытаниях было показано, что лактотрипептиды Val-Pro-Pro и Ile-Pro-Pro обладают хорошими антигипертензивными эффектами. Однако природа C / N-концевых аминокислот и то, содержат ли они гидрофобные аминокислоты, могут не связываться с ингибирующей активностью коротких пептидов ACE. Несмотря на небольшое количество аминокислот в олигопептидах, простые вторичные структуры образуются за счет взаимодействий между ними и влияют на конкуренцию за активную область АПФ. Антигипертензивный препарат каптоприл синтезируется в соответствии с конфигурацией пролина ⁶² .Пептид, ингибирующий АПФ, является конкурентным ингибитором с сильным сродством к активной области АПФ. Его сродство к АПФ выше, чем у ангиотензина I или брадикинина, и его нелегко высвободить из области связывания АПФ, что препятствует двум процессам биохимической реакции: каталитическому гидролизу ангиотензина I в ангиотензин II и каталитическому гидролизу брадикинина в инактивированный фрагмент, снижающий артериальное давление ^16,17 .

Количественный анализ активных пептидов

Пять антиоксидантных пептидов и пять пептидов, ингибирующих АПФ, были идентифицированы с помощью WOP.В частности, четыре пептида, Leu-Tyr, Tyr-Gln, Ala-Pro-Ser-Tyr и Arg-Gly-Gly-Tyr, обладали антиоксидантной активностью и активностью ингибирования АПФ. Высокоэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ВЭЖХ – МС / МС) применялась для оценки концентрации высокоактивных пептидов в WOP. Результаты показали, что содержание Leu-Tyr, Pro-Tyr, Tyr-Gln, Ala-Pro-Ser-Tyr, Arg-Gly-Gly-Tyr и Leu-Val-Ser составляло 155,04 ± 8,36, 2,08 ± 0,12, 1,95 ± 0,06, 22,70 ± 1,35, 0,25 ± 0,01 и 53,01 ± 2,73 мкг / г WOP соответственно (таблица 5).Интересно, что было обнаружено, что четыре пептида обладают как хорошей антиоксидантной активностью, так и активностью ингибирования АПФ. Эти пептиды потенциально могут быть включены в функциональные продукты питания для антиоксидантной защиты или для частичного устранения высокого кровяного давления. В этом исследовании наши результаты были ограничены in vitro. Неясно, действуют ли идентифицированные активные пептиды in vivo. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для оценки эффектов этих активных пептидов in vivo. Предыдущие исследования показали, что биоактивность низкомолекулярных пептидов может сохраняться во время пищеварения в желудочно-кишечном тракте ^32,33 .Биодоступность и метаболизм активных пептидов также будут дополнительно изучены, чтобы лучше понять многофункциональность пептидов.

(PDF) Сравнение методов ABTS и DPPH для оценки общей антиоксидантной способности грудного молока

Martysiak-urowska D., Wenta W., 2012. Сравнение методов ABTS и DPPH для оценки общей антиоксидантной способности

грудного молока. Acta Sci. Pol., Technol. Алимент. 1 (11), 83-89.

88 www.food.actapol.net/

зрелое грудное молоко. J. Matern. Фетальный новорожденный. Med. 11

(4), 275-279.

Aycicek A., Erel O., Kocyigit A., Selek S., Demirkol M.R.,

2006. Грудное молоко обеспечивает лучшую антиоксидантную силу

, чем смеси. Питание 22 (6), 616-619.

Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C., 1995. Использование свободнорадикального метода

для оценки антиоксидантной активности.

Лебенсм. Wiss. у.- Технол 28 (1), 25-30.

Кано А., Акоста М., Арнаро М. Б., 2000. Метод измерения антиоксидантной активности

мочевины в органических средах: применение к

липофильным витаминам. Редокс Реп.5 (6), 365-370.

Compagnoni G., Giuffre B., Lista G., Mosca F., Marini A.,

2004. Уровни CoQ10 в плазме у младенцев, находящихся на грудном вскармливании, сравнимы с

по сравнению с младенцами на искусственном вскармливании. Биол. Новорожденный 86, 165-169.

Куберо Дж., Санчес К.Л., Браво Р., Санчес Дж., Родригес

А.Б., Риверо М., Баррига С., 2009. Анализ активности тиоксидантов ан-

в материнском молоке, дневной и ночной. Cell

Membr. Free Rad. Res. 1 (3), 100-101.

Gossage CP, Deyhim M., Yamini S., Douglass LW, Mo-

ser-Veillon PB, 2002. Каротиноидный состав человеческого молока

человека в течение первого послеродового месяца и ответ

на Добавки с бета-каротином. Являюсь. J. Clin. Nutr.

76 (1), 193–197.

Konieczka P., Namieśnik J., Zygmunt B., 2004. Qual-

оценка качества и контроль качества аналитических результатов.

CDAiMŚ Press, Гданьск, Польша, 128-151.

Li W., Hosseinian F.S., Tsopmo A., Friel J.K., Beta T., 2009.

Оценка антиоксидантной способности и качества аромата грудного молока

. Питание 25 (1), 105-114.

Линдмарк-Манссон Х., Акессон Б., 2000. Антиоксидантные

факторов в молоке. Брит. J. Nutr.Дополнение 1, 103-110.

Lönnerdal B., 2000. Грудное молоко: действительно функциональная пища.

Питание 16 (7-8), 509-511.

Матос К., Моутинью К., Балкао В., Алмейда К., Рибейро М.,

Маркес А.Ф., Герра А., 2009. Общая антиоксидантная активность и количество микроэлементов в материнском молоке: первое 4 месяца

грудного вскармливания. Евро. Food Res. Technol. 230 (2),

201-208.

Пиччиано М.Ф., 2001. Питательный состав грудного молока.

Педиатр. Clin. North Am. 48 (1), 53-67.

Prior R.L., Wu X., Schaich K., 2005. Стандартизированные методы

для определения антиоксидантной способности и фенольных соединений

в пищевых продуктах и ​​диетических добавках. J. Agric. Food Chem.

53, 4290-4302.

Sáenz A.T., Elisia I., Innis S.M., James K. Friel J.K., Kitts

D.D., 2009. Использование ORAC для оценки антиоксидантной способности

грудного молока. J. Food Comp. Анальный. 22 (7-8), 694-698.

Thaipong K., Boonprakob U., Crosby K., Cisneros-Zeval-

los L., Byrne HD, 2006. Сравнение анализов ABTS, DPPH,

FRAP и ORAC для оценки антиоксидантной активности. из экстрактов плодов гуавы. J. Food Comp. Анальный. 19,

669-675.

Туроли Д., Тестолин Г., Занини Р., Белле Р., 2004. Определение окислительного статуса грудного молока и молочных смесей.

Acta Pediatr. 93, 1569–1574.

Вандер Ягта Д.J., Okolob S.N., Costanza A., Blackwellc W.,

Glewa R.H., 2001. Содержание антиоксидантов в молоке

нигерийских женщин и сыворотки их

младенцев, вскармливаемых исключительно грудью. Nutr. Res. 21 (1), 121–128.

Зарбан А., Тахери Ф., Чахканди Т., Шарифзаде Г., Хора-

шадизаде М., 2009. Антиоксидант и улавливание радикалов-

активность человеческого молозива, переходного и зрелого молока

. J. Clin. Биохим. Nutr. 45 (2), 150-154.

PORWNANIE METODY ABTS ORAZ DPPH SŁUŻĄCYCH DO OKREŚLENIA CAŁKOWITEJ ZDOLNOŚCI

PRZECIWUTLENIAJĄCEJ MLEKA LUDZKIEGO

STRESZCZENIE

STRESZCZENIE

. Całkowitą zdolność przeciwutleniajca (TAC) mleka ludzkiego odzwierciedla zawartość i aktywność

w mleku składników, które zapobiegaj degradacji tłusziatlezów dłuszówek. Celem badania

było porównuje testu ABTS и DPPH w odniesieniu do odzysku, precyzji i czułości (granica wykrywalności

i oznaczalności) obu metod słuzanzcyk do gotości.

Materiał i metody. Wartości TAC zostały określone dla dwudziestu pięciu probek mleka uzyskanych od

zdrowych matek, mieszkanek Gdańska, w 14 dobie po porodzie.

Wyniki. Rednia wartość TAC mleka ludzkiego oznaczona testem ABTS wynosiła 19,61 ± 3,311 мг TE (rów-

noważniki Trolox) / 100 см

3

, średnia wartość uzyskana 9,95 мг TE см

3

.

Dla każdej badanej póbki mleka kobiecego poziom TAC określony metodą ABTS był wyższy niż wartości

oznaczone testem DPPH co ma prawdopodobnie związek Соединения с использованием автономного и онлайн-скринингового анализа HPLC

В этом исследовании изучалась антиоксидантная активность ста видов чистых химических соединений, обнаруженных в ряде природных веществ и восточных лекарственных трав (OMH).Для оценки антиоксидантной активности активности по улавливанию радикалов DPPH, активности по улавливанию радикалов ABTS и онлайн-скрининговых анализов HPLC-ABTS использовали три различных метода. Результаты показали, что 17 соединений проявляют лучшую ингибирующую активность против радикала ABTS, чем радикал DPPH. Определена скорость IC ₅₀ для более практичного вещества, а в анализе ABTS IC ₅₀ гидрат галловой кислоты, (+) — гидрат катехина, кофейная кислота, гидрат рутина, гиперозид, кверцетин и соединения кемпферола составили 1 .03 ± 0,25, 3,12 ± 0,51, 1,59 ± 0,06, 4,68 ± 1,24, 3,54 ± 0,39, 1,89 ± 0,33 и 3,70 ± 0,15 μ г / мл соответственно. Анализ ABTS более чувствителен к определению антиоксидантной активности, поскольку он имеет более быструю кинетику реакции и повышенный ответ на антиоксиданты. Кроме того, была очень небольшая погрешность между результатами автономного анализа ABTS и результатами онлайн-скринингового анализа HPLC-ABTS. Мы также оценили влияние 17 соединений на секрецию NO в RAW 264, стимулированном LPS.7 клеток, а также исследовали цитотоксичность 17 соединений с использованием набора для подсчета клеток (CCK), чтобы определить оптимальную концентрацию, которая обеспечит эффективное противовоспалительное действие с минимальной токсичностью. Эти результаты будут занесены в базу данных, и этот метод может стать мощным инструментом предварительного отбора для соединений, предназначенных для изучения на предмет их потенциальной биоактивности и антиоксидантной активности, связанной с их способностью улавливать радикалы.

1. Введение

Натуральные вещества и восточные лекарственные травы (OMH) традиционно применялись для лечения или профилактики различных заболеваний в Азии, включая Корею, Китай и Японию [1].Обычно OMH обладают очень эффективными противораковыми, противовоспалительными и антивирусными свойствами [2], и исследователи сообщают, что эти природные вещества также обладают антиоксидантной активностью. Кроме того, их долгая историческая клиническая практика и надежная терапевтическая эффективность делают их отличными источниками для открытия природных биоактивных соединений [3]. OMH получили широкое внимание из-за их использования в качестве лекарств, функциональных продуктов питания и косметических материалов [1, 4]. Растворитель для экстракции, состоящий из воды и этанола, обычно используется для извлечения биоактивных соединений из OMH с последующим кипячением и дистилляцией для получения полезных компонентов [5].Было показано, что химические компоненты OMH состоят из натуральных продуктов, включая тритерпены, стероиды, алкалоиды, флавоноиды и полисахариды [3, 6]. В ходе нашего исследования потенциальной антиоксидантной активности общеизвестного фитохимического вещества было идентифицировано сто видов чистых соединений. Активные формы кислорода (АФК), которые происходят из кислорода, естественным образом вырабатываются некоторыми ферментами как часть метаболизма в цитоплазме [7, 8]. Однако избыток АФК пагубно сказывается на кислородном отравлении и клеточной дисфункции.Кроме того, избыток АФК также связан с такими заболеваниями, как рак, инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь сердца, артериосклероз, инфекции, старение и аутоиммунные заболевания [8, 9]. Для получения более убедительной информации было проведено множество исследований антиоксидантной активности, которая устраняет АФК [10, 11], и сообщалось, что OMH содержит такие виды антиоксидантов: ABTS, DPPH и ингибирование перекисного окисления липидов. Соответствующие целевые соединения использовались для определения антиоксидантной активности, особенно с использованием радикального метода DPPH или ABTS [12].Недавно были разработаны чувствительные онлайн-методы ВЭЖХ (онлайн-анализы HPLC-DPPH и онлайн-HPLC-ABTS) для анализа активности улавливания свободных радикалов [5, 13]. Была введена онлайн-система для быстрого определения антиоксидантной активности каждого компонента в данных соединениях, а также был разработан онлайн-скрининговый постколоночный анализ ВЭЖХ с использованием радикальных методов DPPH или ABTS, чтобы предоставить новый метод анализа скрининговых технологий, с помощью которого могут быть спектрофотометрический контроль по уменьшению оптической плотности при 515 или 734 нм [14].Этот новый метод был успешно применен для скрининга и определения естественной биоактивности сложных смесей, особенно для OMH [15]. В этом исследовании мы проводим анализы DPPH и ABTS для скрининга антиоксидантной активности ста видов чистых химических соединений, поэтому определяется показатель IC ₅₀ для более практичного вещества. Мы также оценили цитотоксичность 17 соединений, включая (+) — гидрат катехина, каликозин, (3) кофейную кислоту, (4) куркумин, (5) эвгенол, (6) феруловую кислоту, (7) гидрат галловой кислоты, (8) ) гиперозид, (9) кемпферол, (10) магнолол, (11) кверцетин, (12) кверцетин-3-бета-D-глюкозид, (13) гидрат кверцитрина, (14) гидрат рутина, (15) синапиновая кислота, (16) ) ванилилацетон и (17) L — (+) — аскорбиновая кислота, используя анализ CCK для определения оптимальной концентрации, которая будет эффективной для противовоспалительной активности с минимальной токсичностью [9, 16].Кроме того, результаты онлайн-анализа HPLC-ABTS для некоторых соединений были сравнены и проанализированы, чтобы найти более практичный подход к использованию онлайн-скрининговых анализов HPLC-ABTS для быстрого определения пиков на хроматограммах, которые соответствуют биологически активным соединениям.

2. Экспериментальная

2.1. Реагенты и материалы

Сто видов чистых химических соединений были закуплены у KFDA (Корея), Daejung (Корея), Sigma (США), Chem Faces (Китай), TCI (Япония), ChromaDex (США), Fluka (США). , Wako (Япония), GlycoSyn (Новая Зеландия, США), Santa Cruz Biotech (США), China Lang Chem Inc.(Китай) и RD Chemical (США). Для анализов улавливания радикалов использовали следующие реагенты: ABTS (2,2′-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)), DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), персульфат калия и трифторуксусную кислоту (TFA) приобретали у Sigma (США). Метанол и ацетонитрил для ВЭЖХ были приобретены у J. T. Baker (США). Тройную дистиллированную воду фильтровали через мембранный фильтр 0,2 мкм (Advantec, Tokyo, Japan) перед анализом. Материалы для клеточных культур были получены от Lonza (Базель, Швейцария).ЛПС, бычий сывороточный альбумин (БСА) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Антитела для ELISA были получены от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния, США). Химические структуры потенциально выбранных соединений показаны на Рисунке 1.